常用细菌菌种的保存方法

    常用细菌菌种的保存方法有：斜面传代或半固体穿刺细菌菌种石蜡油封存的冰箱保存法、砂土管保存法、冷冻干燥保存法和液氮保存法等。无论采用哪种细菌菌种的保存方法，在进行细菌菌种保存之前都必须保证他是典型的纯培养物，在培养过程中要认真检查，如发现问题应该及时处理。

1、传代培养细菌菌种保存法

传代培养保存是细菌菌种保存常用的简单方法，由于细菌在人工培养基中传代过程中易发生变异，所以传到一定期限时应通过一次易感动物，以保持或者恢复其生物学形状

（1）斜面传代培养保存 ：将细菌接种于琼脂斜面培养基上（如普通琼脂斜面、血液琼脂斜面、鸡蛋琼脂斜面等），置温箱18-24h培养后，将棉塞换成橡胶塞用灭菌固体石蜡熔封，移至4℃冰箱保存，一般细菌在4℃冰箱内可以保存一个月

（2）半固体培养保存 ：用穿刺接种法将细菌接种于半固体培养基内，置温箱培养18-24h后，在表面加上一层无菌液体石蜡，约1厘米，治愈4℃冰箱保存。一般细菌可保存3个月至半年。传代时应先将试管倾斜，使液体石蜡留置一边，再用接种针取细菌细菌菌种接种于新培养基上。

2、砂土管细菌菌种保存法

取清洁的海沙，用1mol/L的氢氧化钠溶液清洗，然后再用1mol/L的盐酸溶液清洗，在后用流水冲洗。分装试管，约2-3厘米深，干热灭菌，加入细菌培养液1mL左右与砂土混匀，置真空干燥管内干燥，待完全干燥后熔封保存。此法多用于保存梭状芽孢杆菌和部分霉菌的保存。可以保存数年。

3、液氮细菌菌种保存方法

（1）将培养物18-24h的菌苔洗下，置于无菌脱脂牛乳中，制成菌悬浊液，分装无菌安培瓶。用喷灯封安培口，并将封后的安培浸入4℃有色液体中浸泡30min，明确熔封后再冷冻

（2）冷冻时先将安培瓶放入4℃冰箱中1h，移至冰格放1h，再置-30~-20℃低温冰箱中冻结30min，然后置于-196℃液氮中保存

（3）细菌菌种使用时，先将从液氮中取出的菌种浸入30-40℃中迅速解冻，再打开安培瓶，取出菌液接种。

再液氮中取放安培瓶时候，小心取放，小心爆炸

4、冷冻干燥细菌菌种保存法

        冷冻干燥细菌菌种保存法又称为冷冻真空干燥法。它综合利用了各种有利于菌种保存的因素，低温、干燥、缺氧等，是目前最有效的菌种保存方法之一。用冷冻干燥保存法保存细菌菌种具有成活率高、变异性小等优点，保存期一般在10年以上。

冷冻干燥细菌菌种保存法是将待保存的微生物细胞或者孢子悬浮在合适的保护剂中，预先将细胞冷冻，使水冻结，然后在真空条件下，使冰升华以除去大部分水，残留的一些不冻结的水分，再通过蒸发从细胞中除去。

        为了减少冷冻、脱水等过程对细胞所造成的损伤，在冷冻处理时必须把细胞或者孢子悬浮在合适的保护剂中，保护剂通常是高分子物质，如脱脂牛奶、血清等，或者是高分子物质和低分子物质如葡萄糖、蔗糖、谷氨酰胺等的混合物。低分子物质起着水分缓冲剂的作用，使干燥样品中的最终含水量不至于过低，如添加7.5%葡萄糖可使干燥样品中最终水分保持在1%左右。据报道，样品中的残留水分是影响存活率的主要因素之一，但也不是冷冻样品中谁越少越好，样品中以保持1.5%---3%的水分为宜